Tìm hiểu chuyên sâu về Đông trùng hạ thảo Cordyceps Militaris phổ biến tại Việt Nam

THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ CÔNG DỤNG CỦA CORDYCEPS MILITARIS

1. Các thành phần hóa học của nấm Cordyceps militaris.

Theo số liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của thể quả nấm C.militaris cho thấy loài nấm này chứa các thành phần như: protein chiếm 40,69%; các loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học và nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1,52%), cordycepic acid (11,8%), polychaccaride (30%) (Shih et al., 2007).

• Acid amin

Kết quả nghiên cứu của Hyun (2008) cho thấy trong quả thể nấm Cordyceps militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm (69,32 mg/g trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm). Khối lượng acid amin mỗi trong quả thể và sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao động từ 1,15 ̣ -15,06 mg/g và 0,36-2,99 mg/g. Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả thể bao gồm: lysine (15,06 mg/g), glutamic acid (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g) in the fruiting body. Số liệu phân tích của Chang và ctv. (2001) cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g) (Chang, 2001).

• Acid béo

Quả thể nấm Cordyceps militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm 70% tổng số acid béo, trong đó lương acid linoleic chiếm đến 61,3% ̣ trong quả thể và 21,5% trong sinh khối. Lượng acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối (Hur, 2008).

• Adenosine và cordycepin

Adenosine và cordycepin là hai hơp chất có dược tính cao của nấm Cordyceps militaris. Adenosine chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong sinh khối nấm. Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với sinh khối (0,97% so với 0,36%) (Hyun et al, 2008).

• Polysaccharide

Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 được tách chiết từ nấm Cordyceps militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường monosaccharide, mannose và galactose. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loại polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất. Yan et al., 2008 cho rằng tác dụng này có thể do chức năng kháng oxy hóa của các polysaccharide từ nấm.

2. Tác dụng của Đông trùng hạ thảo Việt Nam Cordyceps Militaris.

Các hợp chất dược liệu của loài nấm Cordyceps militaris ứng dụng trong điều trị bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó loài nấm này có giá tri ̣kinh tế cao. Nấm Cordyceps militaris rất khan hiếm trong tự nhiên. Vì vậy, việc sản xuất ở quy mô lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều trị bệnh từ Cordyceps militaris hiện đang là một vấn đề cấp thiết.

• Các hợp chất chống ung thư:

Hợp chất cordycepin (3′ -deoxyadenosine) từ nấm cho thấy có hoat tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa miên dịch (Shonkor et al, 2010).

Nhiều nghiên cứu lâm sàng, được thực hiện ở Trung Quốc và Nhật Bản với các bệnh nhân ung thư (Wang và cộng sự, 2001) Cordyceps được sử dụng, đã mang lại kết quả tích cực. Trong một nghiên cứu 50 bệnh nhân bị ung thư phổi, được sử dụng Trùng Thảo với 6 gram mỗi ngày kết hợp với hóa trị liệu, các khối u là giảm ở 46% bệnh nhân được nghiên cứu. Một thử nghiệm liên quan đến bệnh nhân ung thư với một số loại khác nhau các khối u thấy rằng Trùng Thảo được dùng trong thời gian 2 tháng ở mức 6 g / ngày, cải thiện các triệu chứng ở đa số bệnh nhân. Số tế bào bạch cầu được giữ cao trong khi kích thước khối u là giảm đáng kể trên khoảng một nửa số bệnh nhân. (Zhou et al (1998).

Jae Won Ha (2006) và cs nghiên cứu ảnh hưởng của chiết suất C. militaris lên hoạt động điều hòa miễn dịch và chống khối u đã kết luận rằng các chiết suất của C. militaris là một loại thuốc thảo dược hiểu quả cho hoạt động điều tiết miễn dịch và điều trị chống ung thư bằng cách thúc đấy hoạt động của các đại thực bào và nitric oxide (nitric oxide – NO có ảnh hưởng lên sự mở rộng của các mạch máu để giúp tăng dòng chảy của máu, đưa oxy và các chất dinh dưỡng vào tế bào cơ, điều khiển lưu lượng máu đến từng phần của cơ thể. Nhờ sự tác động của NO này mà việc hình thành mảng bám trên thành động mạch do mỡ và các cholesterol xấu được giảm thiểu, từ đó ngăn chặn nguy cơ mắc các bệnh tim mạch trong cơ thể của con người).

Tác dụng chống ung thư được đề cập đến trong nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả ở nhiều quốc gia trên thế giới. Dịch chiết từ thể quả Cordyceps militaris có tác dụng chống ung thư, hiệu quả đối với hai loại tế bào màng trong tĩnh mạch rốn là HT1080 và B16-F10 do có khả năng chống lại sự tạo thành các mạch máu mới bằng cách giảm sự biểu hiện của bFGF, một trong những nhân tố kích thích quá trình này. Do có vai trò kìm hãm quá trình tạo thành các mạch máu mà có thể ngăn chặn được quá trình di căn và sự phát triển của tế bào ung thư (Yoo H.S et al., 2004). Dịch chiết nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư vú, ung thư phổi (Ahn Y.J. et al., 2001). Dịch chiết bằng nước ấm nấm Cordyceps militaris có tác dụng kìm hãm sự phát triển của dòng tế bào ung thư máu ở người bằng cách gây ra hiện tượng tự chết của các tế bào thông qua sự hoạt hoá enzym caspase-3 (Lee H. et al., 2006). Thí nghiệm của Kim G.Y. và đồng tác giả (2006) cũng cho kết quả tương tự với khả năng điều trị ung thư máu của dịch chiết từ nấm Cordyceps militaris. Các nhà khoa học cũng đã sử dụng dịch chiết từ loài nấm này để thử nghiệm trên các dòng tế bào bình thường và các dòng tế bào ung thư. Kết quả cho thấy hai dòng tế bào K562 (tế bào ung thư máu leukemia) và Du145 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt – prostate carcinoma) bị ức chế mạnh bởi dịch chiết bằng dung môi butanol.

Theo Khan et al.(2010) hợp chất codycepin trong nấm ĐTHT có khả năng ức chế sự phát triển của khối u, kéo dài thời gian sống cho những con chuột được cấy tế bào Sarcoma S180 và ức chế sự phát triển và di căn của tế bào ung thư ở những con chuột. Dịch chiết từ nấm ĐTHT ức chế sự phát triển của tế bào máu từ cuống rốn (human umbilical vein endothelial cells – HUVEC), dòng tế bào mô mềm Sarcoma gây ung thư ác tính HT1080. Dịch chiết của nấm này cũng giảm metalloproteinase 2(mmp2) biểu hiện gen trong tế bào HT1080. Mới đây người ta cũng đã phát hiện ra một emzym phân giải protein từ các quả thể khô của Cordyceps militaris có khả năng chống lại tính độc của các tế bào u vú và ung thư bàng quang. Cơ chế chống ung thư quan trọng nhất của nấm ĐTHT là hoạt hóa lại quá trình apoptosis (tế bào tự chết) của các tế bào ung thư. Trong một nghiên cứu Park et al. (2009) quan sát thấy rằng dịch chiết ĐTHT ức chế sự tăng trưởng tế bào bạch cầu U937 ở người bằng cách làm biến dạng hình thái của tế bào hoặc làm cho tế bào chết theo chương trình apoptosis (chương trình tự chết của tế bào). Một nghiên cứu khác cũng chứng minh khả năng ức chế tăng trưởng và gây ra sự chết tế bào của nước chiết nấm Cordyceps militaris trong điều trị tế bào ung thư phổi A594 (Thakur et al., 2011).

Ana Bizarro và cs (2015), chiết suất methanol của C. militaris gần đây cho thấy có hoạt động ức chế tăng trưởng tế bào khối u ở một số tế báo khối u trên người. Nghiên cứu của tác giả đã cho thấy chiết xuất methanolic của quả thể C.militaris đã làm giảm tế bào khối u NCI-H460.

• Hoạt tính kháng oxy hóa:

Các nghiên cứu cho thấy hợp chất CM-hs-CPS2 chứa trong dịch chiết nấm C.militaris có tính kháng DPPH, hoaṭ hoạt tính khử và tạo phức ở nồng độ (8 mg/ml) là 89%, ̣1,188 và 85% (Fengyao et al., 2011).

Chống lão hoá, chống các chứng viêm tấy được thể hiện trong công trình nghiên cứu của Won S.Y và Park E.H. (2005). Ahn Y.J. và đồng tác giả (2000) cho rằng nấm Đông trùng hạ thảo có tác dụng chống viêm nhiễm kìm hãm sự phát triển của một số virut, vi khuẩn và nấm. Ngoài ra nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris còn có tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipit, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig J.E và Kamendulis L.M., 2004).

Các nghiên cứu của Filipa S và CS (2013) đã cho thấy chiết suất methanol của C. militaris có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm và chống tế bào ung thư ở người. Các chiết suất methanol của C. militaris đã chứng minh ức chế sự oxy hóa, làm giảm năng lượng và diệt gốc tự do. Chiết suất của C. militaris có thể ức chế sự phát triển của tế bào MCF-7 (u vú), NCI-H460 (u phổi), HCT -15 (u đại tràng).

• Tăng số lượng tinh trùng:

Nghiên cứu trên lợn cho thấy khi dùng chế phẩm từ Cordyceps militaris, số lượng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh trùng di động và hı̀nh dạng bình thường tăng. Hiệu quả này được duy trì thậm chí sau 2 tuần ngưng sử dung chế phẩm. Lượng cordycepin trong ̣tế bào tăng trong thời gian sử dụng chế phẩm nên có khả năng chất này làm tăng lượng tinh dịch và chất lượng tinh trùng ở lợn (Lin ̣ et al., 2007).

• Hạn chế cúm:

Acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong điều trị cúm A. Chất này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào (Yuko et al., 2007).

• Kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ung thư:

Protein (CMP) tách chiết từ nấm có kích thước 12kDa, pI 5,1 và có hoạt tính trong khoảng pH 7-9. Protein này ức chế nấm Fusarium oxysporum và gây đôc đối với hoạt tính tế bào ung thư bàng quan (Byung-Tae et al., 2009). Hơp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Clostridium. Các hợp chất dẫn xuất từ nấm được mong đợi ứng dụng trong việc điều trị nhiễm khuẩn các bệnh đường ruột (Young-Joon ̣ et al., 2000). Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh tiểu đường thông qua việc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF- ̣ κB, do đó đươc hy vọng sẽ ứng dụng như một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều trị các bệnh về miễn dịch (Seulmee ̣ et al., 2009).

• Tan huyết khối:

Enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có hoạt tính gắn fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin. Enzyme này có khả năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất. Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiêu cho các enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở người (Jae-Sung et al., 2006).

• Tính kháng viêm:

Để xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch chiết từ quả thể nấm Cordyceps militaris (CMWE) được thử nghiệm về tác dụng kiểm soát lipopolysaccharide (LPS) (chịu trách nhiệm kích thích việc sản xuất nitric oxide), việc phóng thích yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) của tế bào RAW 264,7. Các đại thực bào đươc xử lý với nồng độ khác nhau của CMWE làm giảm đáng kể LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết. Những ̣ kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào (Wol et al., 2010).

Pooja Pathania và Anand Sagar (2014) đã nghiên cứu hiệu quả chống khuẩn của C. militaris. Theo Pooja Pathania và Anand Sagar khi sử dụng chiết suất methanol của C. militaris ở nồng độ 100% thì chống được 19,6% S. aureus và 25,09% E. coli. Với chiết suất C. militaris bằng nước thì tỉ lệ kháng S. aureus là 17,64% và E. coli là 22,74%.

Gao Jian và CS (2011) đã nghiên cứu về tác dụng làm giảm lipit của cordycepin chiết suất từ C. militaris trên chuột đã cho thấy: chuột sau khi cho ăn cordycepin ở nồng độ 12,5; 25; 50mg/kg thể trọng đã làm giảm cholesterol toàn phần (TC), giảm triglyceride,  LDL-C và tăng VLDL-C .

3. Các ứng dụng trên lâm sàng của nấm Cordyceps militaris:

Mặc dù nấm Cordyceps sinensis được sử dụng rộng rãi hơn Cordyceps militaris, tuy nhiên các ứng dụng lâm sàng của chúng cũng khá tương tự nhau. Các chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris có thể được sử dụng trong các trường hợp suy giảm chức năng phổi, ho có đờm, chóng mặt (Mizuno, 1999; Das et al., 2010).

Bệnh nhân suy thận mạn tính hoặc suy giảm chức năng thận thường bị tăng huyết áp, protein niệu và thiếu máu. Trong một nghiên cứu với những bệnh nhân này, người ta phát hiện ra rằng sau một tháng với Trùng Thảo, 15% giảm huyết áp đã được quan sát. Protein niệu cũng giảm đáng kể. Ngoài ra, tăng silutox dismutase (SOD) đã được ghi nhận.

Trong một nghiên cứu lâm sàng khác trên người người, 57 bệnh nhân bị tổn thương thận do gentamicin gây ra đã được điều trị với 4,5 gram Cordyceps mỗi ngày hoặc bằng các phương pháp thông thường khác. Sau sáu ngày, nhóm nhận được Cordyceps đã phục hồi 89% chức năng thận bình thường của họ; trong khi nhóm đối chứng phục hồi chỉ 45% chức năng thận bình thường. Thời gian phục hồi cũng ngắn hơn đáng kể trong nhóm sử dụng Cordyceps khi so sánh với nhóm đối chứng.

Các tác giả Lei Zhong và CS (2017) đã nghiên cứu hỗ hợp của ngũ cốc với C. militaris trong việc chống mệt mỏi trên chuột đã cho kết quả:  ngũ cốc và ngũ cốc trộn C. militaris đã có tác động đáng kể đối với chống mệt mỏi của chuột. Trong nhóm ngũ cốc trộn C. militaris thì công thức trộn C. militaris ở liều lượng 20g. Hỗn hợp ngũ cốc C. militaris đã loại bỏ hiệu quả axit lactic máu bằng cách tăng lượng lactate dehydrogenase và giảm creatine kinase cấp. Hỗ hợp ngũ cốc C. militaris cũng góp phần làm giảm protein bằng cách giảm lượng đạm trong máu. Ngoài ra, hồn hợp ngũ cốc cải thiện enzyme chống oxy hòa tế bào nội sinh bằng cách giảm malondialdehyd và tăng các hoạt động catalase, glutathione peroxidase (GSH-Px) và superoxide dismutase (SOD).

Phạm vi sử dụng chữa bệnh của loài Cordyceps rất lớn. Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Cordyceps đã được sử dụng để điều trị một loạt các bệnh bao gồm bệnh về hô hấp, bệnh phổi, thận, gan, bệnh tim mạch, động kinh, và tiểu đường. Nó cũng thường xuyên được sử dụng trong tất cả các loại bệnh về rối loạn miễn dịch, và là một chất bổ trợ trong điều trị ung thư.

(Zhou et. al. 1998) Cordyceps được sử dụng trong biện pháp khắc phục sự suy nhược và mệt mỏi và thường được sử dụng như một chất làm trẻ hóa tổng thể để tăng năng lượng trong khi hồi phục từ bệnh nặng. Nó được sử dụng trong phương pháp chữa trị nâng cao hoạt động sinh lý dục ở cả nam và nữ. Cordyceps thường được kê đơn cho người già để giảm đau nhức nói chung. Các bác sỹ y học cổ truyền Trung Quốc cũng khuyên nên sử dụng thường xuyên Cordyceps để tăng sức đề kháng nhiễm trùng, điều trị cảm lạnh và hôi miệng và thường cải thiện sự cân bằng nội tiết của bệnh nhân. Theo truyền thống Cordyceps thường được sử dụng cho các vấn đề về thận và phổi, hoặc các vấn đề sức khoẻ được cho là xuất phát từ tim mạch, phổi hoặc thận. Ví dụ, nó được sử dụng để giảm bớt một loạt các bệnh về hô hấp như: giảm ho và đờm, thở dốc, khó chịu phế quản, và hen suyễn. Khoa học hiện đại đã khẳng định hiệu quả của Cordyceps đối với hầu hết các bệnh kể trên.

Jin Young Heo và CS (2015) đã xác định hiệu quả và tính an toàn của C. militaris ở người trưởng thành Hàn Quốc bị rối loạn chức năng gan nhẹ. Liều lượng dùng trong nghiên cứu của Jin Young Heo và CS là C. militaris 1,5g/ngày, các tá dược được sử dụng như nhau trong nhóm đối chứng và nhóm nghiên cứu. Kết quả trong phân tích CT gan sau 8 tuần cho thấy tỉ lệ đơn vị HU của 8 đoạn gan tăng trung bình là 21.43%±45.11% cho nhóm sử dụng C. militaris và nhóm không sử dụng là 9.64%±11.41%. Kết quả cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Như vậy, chiết xuất C. militaris được sử dụng như một loại thực phẩm chức năn ở những bệnh nhân bị rối loạn chức năng gan nhẹ và góp phần làm giảm sự phát triển của xơ gan gây ra bở sự tích tụ lipit trong tế bào gan.

4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi trồng nấm Cordyceps militaris

Nấm dược liệu từ lâu đã là một phần quan trọng của văn hóa và nền văn minh nhân loại, đặc biệt các loài trong giống Cordyceps được đánh giá cao về dược tính (McKenna et al., 2002). Hầu hết các loài Cordyceps ký sinh trên ấu trùng côn trùng hoăc các loài chân đốt (Kobayasi et al., 1941; 1982).

Loài nấm Đông trùng hạ thảo có giá trị kinh tế cao nhất trong giống này là Cordyceps sinensis (Berk.), là loài ký sinh trên sâu bướm (Wang Yao et al., 2011), phân bố ở cao nguyên Tây Tạng của Trung Quốc và đồng cỏ trên cao của Nepal, Bhutan và Ấn Độ (Shrestha et al., 2010; Zhang et al., 2012]. O. sinensis là một loại nấm dược liệu có giá trị cao, được thu hái và giao dịch từ lâu đời (Jones et al., 1997; Halpern, 1999). Do bị khai thác triệt để, số lượng của O. sinensis trong tự nhiên giảm mạnh (Li et al., 2006;. Stone, 2008; Zhang, 2012).

Sự khan hiếm và giá bán trên thị trường cao đã dẫn đến việc xuất hiện nhiều nấm giả bán trên thị trường dưới nhiều dang như dùng những loài nấm có hình thái quả thể giống với loài O. sinensis, hoặc ép khuôn tạo hình dáng tương tự O. sinensis từ các loại bột và dược liệu.

Một loài trùng thảo phổ biến khác là loài Cordyceps militaris (. L: Fr.) Link, có phân bố trên toàn thế giới ở độ cao từ 0 -2.000 m trên mực nước biển (Kobayasi et al., 1941; Mains, 1958; Panigrahi et al., 1995; Shrestha và Sung, 2005; Ma et al., 2007). Loài này thường được gọi là nấm cam sâu bướm, có thể dễ dàng nuôi nhân tạo bằng cả hai phương pháp rắn và lỏng trong môi trường có nhiều nguồn carbon và nitơ.

C. militaris đươc xem như một nguồn thay thế cho O. sinensis do nó chứa các hợp chất hóa học và dược tính tương tự như nấm O. sinensis như: hoạt tính chống oxy hóa, ức chế tế bào ung thư… (Gong et al., 2006a,b ; Huang et al., 2006; Yu et al., 2006; Ni et al., 2007; Gao et al., 2008; Yue et al., 2008; Zhou et al., 2009; Das et al., 2010; Khan et al., 2010; Li et al., 2010; Zheng et a.l, 2011; Dong et al., 2012).

Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu dược lý sâu hơn nhằm xác định các hợp chất tinh khiết khác ngoài cordycepin để xác định và so sánh chính xác giá trị dinh dưỡng của hai loài này (Paterson et al., 2008).

Khác với loài O. sinensis không nuôi trồng được hoàn chỉnh để tạo quả thể trong môi trường nhân tạo, nấm C. militaris có vòng đời hoàn chỉnh khi nuôi cấy trong môi trường nhân tạo, do đó loài này được sử dụng làm mô hình để nghiên cứu các loài nấm thuộc giống Cordyceps khác (Shrestha et al., 2004; Gao et al., 2008; Zhong et al., 2009; Xiong et al., 2010). Không phân bố ở các điều kiện địa lý nghiêm ngặt như O. sinensis, loài nấm C. militaris có phân bố rộng trên toàn thế giới. Tuy nhiên, mật độ trong tự nhiên của nấm lại không ̣đáng kể, và sản lượng quả thể thể nấm này trong tự nhiên rất thấp, do đó trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu trên việc nuôi cấy quy mô lớn quả thể và sợi nấm này cho ứng dụng trong dược liệu (Dai et al., 2007; Gu et al., 2007).

Từ cuối thế kỷ 19, các nhà khoa học đã công bố các nghiên cứu tạo quả thể nấm trên côn trùng (de Bary et al., 1887; Shanor et al., 1936; MüllerKögler et al., 1965; Leatherdale, 1970) và sau đó là các nghiên cứu nuôi trồng thành công nấm trên các hợp chất hữu cơ trong quy mô phòng thí nghiêm ̣(Kobayasi et al., 1941; Basith và Madelin, 1968; Yue et al., 1982).

Nguyên do lý giải cho khả năng nuôi trồng nấm C.militaris trên môi trường không chứa dịch chiết côn trùng vẫn chưa được lý giải thỏa đáng nhưng thành quả của các nghiên cứu này đã đóng góp to lớn cho viêc phát triển quy mô nuôi cấy cỡ lớn hơn. Để đáp ứng nhu cầu về các dược chất từ nấm C.militaris, cùng với việc nuôi cấy thu quả thể, việc sản xuất hệ sợi C.militaris trong môi trường lỏng cũng là một hướng đi hứa hẹn để sản xuất ra các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ nấm này (Huang et al., 2006; Yu et al., 2006; Gu et al.,2007; Kwon et al., 2009; Xie et al., 2009a, b ; Das et al., 2010). Các nghiên cứu sâu về các hợp chất sinh hóa và dược chất của nấm tiếp theo đó cũng đã được công bố trong những năm gần đây (Paterson et al., 2008; Zhou et al., 2009; Das et al., 2010). Nấm Cordyceps militaris khi nuôi trên các môi trường khác nhau sẽ có các hình thái khác nhau.

• Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến quá trình nuôi trồng nấm

Cordyceps militaris được trồng trong môi trường lỏng để thu hoạch sợi nấm đồng thời trên môi trường rắn để thu quả thể. Các tác giả Kim và Liu đã tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chìm nấm C.militaris (Kim et al., 2003; Liu et al., 2008). Để sản xuất quy mô lớn về số lượng quả thể nấm C.militaris hiện nay người ta chỉ sử dụng môi trường rắn chứa các cơ chất nhân tạo hoặc môi trường rắn chứa côn trùng (ví dụ, ấu trùng tằm B. mori).

Tuy nhiên, việc nuôi nấm lấy quả thể trên côn trùng rất tốn kém, do đó hiên nay nấm chủ yếu được nuôi trên môi trường có thành phần chính là gạo. Các môi trường dùng cho nuôi cấy bao gồm môi trường nhân giống, môi trường tiền nuôi cấy hệ sợi và môi trường sản xuất. Thành phần các môi trường này khác nhau phù hợp với sự phát triển của nấm ở các giai đoạn. Có 4 giai đoạn chính trong sự phát triển của nấm, bao gồm: giai đoạn tạo hệ sợi, giai đoạn tạo sắc tố, giai đoạn nảy chồi, và giai đoạn tạo quả thể (Lu et al., 2005). Các quá trı̀nh này đòi hỏi việc kiểm soát chặt chẽ về nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng (Ren et al., 2009)

Việc nuôi cấy các loại nấm trên môi trường rắn đã được nghiên cứu trong nhiều năm qua. So sánh với các loại môi trường khác, môi trường rắn hiệu quả hơn về các mặt như diện tích nuôi trồng nhỏ, giảm lượng nước tiêu thụ so với nuôi cấy lỏng, ̣đồng thời giảm chi phí xử lý nước thải và tiêu thụ năng lượng trong quy trình nuôi nấm. Trong tự nhiên nấm C. militaris sinh trưởng rất hạn chế ký sinh trên côn trùng. Khi nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo nấm có thể phát triển trong điều kiện tối ưu như độ thoáng khí giúp cho viêc phát triển sợi nấm và quả thể, nhất là chủ yếu quả thể chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học hơn (Sung et al., 2006; Zhang et al., 2008). Quả thể đã được trồng thành công trên môi trường gao lứt (Choi et al., 1999; Sung et al., 2002) hoặc ấu trùng côn trùng (Harada et al., 1995; Sato và Shimazu, 2002). Các nghiên cứu khác cũng cho thấy việc sử dụng hạt kê có thể tạo ra nấm có hàm lượng adenosine cao. Các nghiên cứu cũng cho thấy khi hạt đậu nàng được dùng làm môi trường rắn hàm lượng cordycepin tăng so với giá thể gạo (Lim et al., 2012). 

• Ảnh hưởng của dinh dưỡng trong môi trường nuôi nấm

Nguồn dinh dưỡng từ côn trùng: Môi trường nuôi cấy nấm có thể dùng các loại nhộng và sâu khác nhau, nhưng hầu hết sử dụng nhộng tằm Bombyx mori (Hong et al., 2010). Các nghiên cứu cũng cho thấy có khả năng sử dụng các loại côn trùng khác để nuôi nấm như ấu trùng bướm đêm Antherea pernyi (Wang et al., 2002), Mamestra brassicae (Harada et al., 1995)…

Nguồn dinh dưỡng từ các hợp chất hữu cơ tự nhiên: Việc sử dụng côn trùng trong nuôi cấy nấm ở quy mô lớn cho thấy nhiều hạn chế về mặt nguyên liệu sẵn có, sự tạp nhiễm trong quá trình nuôi cao hơn, do đó các hợp chất hữu cơ đã được sử dụng để thay thế côn trùng. Xie và ctv cho thấy việc bổ sung gao lứt, lúa mạch và đậu nành vào môi trường nuôi cấy thích hợp để thay thế côn trùng (Xie et al., 2009b). Tuy nhiên, Yahagi cũng chỉ ra rằng môi trường dinh dưỡng trên thạch không phù hợp cho việc sản xuất nấm (Yahagi et al., 2004). Các hormone thực vật như 2, 4-D, citric acid ̣triamine, colchi-cines cũng cho thấy có ảnh hưởng đến năng suất quả thể (Wang et al., 2010). Nghiên cứu của Li năm 2004 và Dong năm 2012 cho thấy việc bổ sung các muối khoáng như K+, Mg2+, Ca2+ ở nồng độ khoáng 0.1 g/L cũng có thể tăng năng suất quả thể và hàm lượng các hoạt chất sinh học trong nấm (Li et al., 2004; Dong et al., 2012). Thời gian tạo quả thể nấm dao động theo loại môi trường sản xuất quả thể, thường trong khoảng 35-70 ngày (Du et al., 2010). Zhang và Liu (1997) kết luận trên môi trường gạo cần 35–45 ngày cho thời gian thu hoạch thể, tuy nhiên khi sử dụng các môi trường khác thì thời gian tạo quả thể sẽ dài hơn như khi dùng hạt kê, ngô làm môi trường trồng ̣nấm.

Jae Sung Kim và đồng tác giả (2006), tại Hàn Quốc, đã sử dụng nhộng tằm để nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps militaris. Nhộng tằm được đựng trong trong các lọ nuôi cấy, khử trùng ở 1210C trong thời gian 90 phút, để nguội, cấy giống nấm, 20 ngày sợi nấm ăn kín toàn bộ giá thể, trong điều kiện nhiệt độ 20-250C, cường độ ánh sáng 500-700 lux đã hình thành mầm thể quả. Nuôi cấy thu sinh khối hệ sợi cũng được các tác giả tiến hành trên môi trường dinh dưỡng lỏng với thành phần như sau: 40 g/lít đường glucose, 10 g/lít cao nấm men, 0.5 g/lít KH2PO4, 0.5 g/lít K2HPO4:3H2O, và 0.5 g/lít MgSO4.7H2O.

Tác giả Mohammad Soltani và CS (2015) nghiên cứu môi trường PDA có bổ xung thêm malt extract (ME) và Yeast extract (YE) và môi trường PDA. Kết quả cho thấy môi đường kính khuẩn lạc của C. militaris sau 21 ngày trên môi trường PDA là 4,8 cm trong khi đó môi trường PDA + ME 6g/l cho đường kính khuẩn lạc là 6,8 cm sau 17 ngày. Kết quả của tác giả Mohammad Soltani và CS cũng chỉ ra rằng môi trường PDA + 4g/6g (YE/ME) cho đường kính khuẩn lạc cao nhất là 7,7cm  sau khoảng 15 ngày. Như vậy kết quả nghiên cứu của tác giả đã chỉ ra rằng đường kính khuẩn lạc C. militaris chị sự tác tộng của ME và YE trên môi trường agar.

Theo Xiaoli Liu (2014) Đối với môi trường nuôi quả thể: gạo nứt 30g; 1g bột nhộng tằm; 45 ml dịch( 2% dextrose, 1 % pepton, 0,1% KH2PO4, 0,1% MgSO4, 0,1% VB1).

Andrej Gregori (2014) đã nghiên cứu thử nghiệm nuôi trồng 5 chủng C. militaris trên môi trường sử dụng bã bia từ 0-60%. Kết quả nghiên cứu của Andrej Gregori cho thấy tất cả các chủng thử nghiệm đã không mọc quả thể ở công thức có lượng bã bia > 50%. Nồng độ Cordycepin cao là 10,2mg/g của chủng CM2. Trong đó đáng chú ý nhất là chủng CM11 có nồng độ Cordycepin lên tới 787,11mg/g.

Theo Kang C và CS (2014) môi trường lên men giống cấp 2 gồm: sucrose 20 g/L; peptone 20 g/L; KH2PO4 1 g/L; and MgSO4·7H2O 0.5 g/L; pH tự nhiên, nhiệt độ nuôi là 25oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, trong 5 ngày. Trong môi trường sản xuất thêm vào 1g/l Adenine và 16g/l Glycine sau 4 ngày, 10 ngày và 30 ngày.

Năm 2016 tác giả Mani A, Thawani V và Zaidi KU đã sử dụng môi trường có thàn phần (Glucose 80g/L; NH4NO3 2g/L; KH2PO4 10g/L; MgSO4·7H2O 0.25g/L; FeCl3·6H2O 0.02g/L; MnSO4 0.014g/L; pH 4.5), để nuôi cấy loài C. militaris ở điều kiện 20oc, tốc độ lắc là 180 vòng/phút.

Theo Xiaoli Liu (2014) môi trường nhân giống gồm: 100ml dung dịch môi trường tổng hợp đường khoai tây, KH2PO4 0,5g/l; MgSO4 1g/l; Vitamin B1 0,1g/l. Nuôi ở điều kiện 20oc, tốc độ lắc là 120 vòng/phút, để trong tối 5 ngày.

Naru Kang và cs (2017) khi nghiên cứu lai tạo các chủng C. militaris với nhau nhằm tạo ra chủng có hàm lượng Cordycepin cao đã sử dụng môi trường nhộng tằm kết hợp với môi trường PDB trong điều kiện nhiệt độ 25oC, tốc độ lắc là 120 vòng/phút. Sau 7 ngày lắc chuyển sang môi trường nuôi cấy gồm có: 40g gạo nứt trộn với 64ml dịch (20g sucurose/lít; 20g pepton; 1g MgSO4.7H20; 0,5g KH2PO4).

Mohd Adnan và cs (2017) đã đưa ra môi trường sản xuất giống cấp 2 gồm: glucose 1.5%, peptone 0.5%, KH2PO4 0.3%, K2HPO4 0.1%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.05%. Môi trường sản xuất gồm 20g gạo nứt; 32 ml dung dịch (glucose 1.5%, peptone 0.5%, KH2PO4 0.3%, K2HPO4 0.1%, MgSO4 0.05%, NaCl 0.05%). Hấp khử trùng ở điều kiện nhiệt độ 121oC trong 30 phút.

Theo nghiên cứu của Wen TC và CS (2017), khi nghiên cứu các điều kiện làm tăng hàm lượng cordycepin trên ba chủng C. militaris GACP08Y5 và GACPO8Y1, GACP0746 trong môi trường lỏng đã cho thấy sự khác biệt. Kết quả chủng GACP08Y5 cho hàm lượng cordycepin cao nhất là 3005,83 mg/l.

• Nghiên cứu về môi trường nuôi trồng quả thể:

Những nghiên cứu ban đầu trên thế giới về môi trường nuôi trồng nhộng trùng thảo được thực hiện trên côn trùng. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp nuôi trồng này là giá thành kinh tế cao, sản lượng thấp.

Theo Shrestha (2012), ngũ cốc và một số chất hữu cơ khác được chứng minh là cơ chất tốt để thay thế côn trùng. Năm 1941, Kobayasi đã nghiên cứu sự hình thành quả thể của nhộng trùng thảo trên cơ chất gạo.

Kể từ đó, gạo được sử dụng như một thành phần chủ yếu cho sự sinh trưởng quả thể của nhộng trùng thảo (Li, 2002; Zhang 2003; Li et al., 2006; Wen et al., 2008). Gạo Husked thường được sử dụng trong nuôi trồng nhộng trùng thảo. Năng suất quả thể lớn nhất thu được khi sử dụng gạo (Wen et al., 2008). Bên cạnh đó, một số cơ chất hữu cơ khác có thể được sử dụng để nuôi trồng nhộng trùng thảo bao gồm: bột đậu, hạt ngô, lõi ngô, vỏ hạt bông,kê, lúa miến, lúa mì, ngũ gốc, hoa hướng dương (Li et a., 2004; Zhao et al., 2006). Gạo trộn với nhộng tằm được chứng minh là cơ chất tốt hơn các cơ chất khác và cho đến nay thường được sử dụng làm môi trường nuôi trồng (Zhao et al., 2006; Jin et al., 2009). Môi trường chứa Agar không phù hợp cho sự hình thành quả thể (Yahagi et al., 2004). Hàm lượng nitơ trong môi trường nuôi trồng nhộng trùng thảo tương đối thấp. Nếu hàm lượng nitơ quá nhiều trong môi trường sẽ làm chậm quá trình biệt hóa để hình thành quả thể (Gao et al., 2000, Kobayasi, 1941). Thời gian nuôi trồng nhộng trùng thảo phụ thuộc vào hình dạng và thể tích bình nuôi cấy. Quả thể thường được hình thành trong khoảng 35-70 ngày (Yue, 2010). Theo Zhang và Liu (1997) giai đoạn hình thành quả thể là 35 -45 ngày trên cơ chất chính là gạo và 40 -70 ngày trên các cơ chất khác như ngô, kê và gạo Tussah.

Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng lớn đến việc tạo quả thể trong nuôi trồng nấm. Các nghiên cứu cho thấy khoảng nhiệt độ 18–22 °C là tối ưu cho sự sinh trưởng sinh khối nấm và năng suất quả thể. Tuy nhiên, quá trình này sẽ giảm mạnh khi tăng nhiêt độ trên 25 oC (Sung et al., 1999, 2002; Gao et al., 2000). Do đó, cần lưu ý về yếu tố nhiệt độ môi trường khi trồng nấm và phải đảm bảo điều kiện này khi tiến hành nuôi trồng nấm ở khu vực có nhiệt độ môi trường không thích hợp, như sử dụng máy điều hòa.

Mohd Adnan và cs (2017) đã nghiên cứu tác động của các điều kiện lên men (pH, nhiệt độ, thời gian ủ), môi trường lên men (lúa mì, yến mạch, lúa gạo) đến hàm lượng cordycepin. Kết quả nghiên cứu của Mohd Adnam và CS đã cho thấy nhiệt đô, pH và thời gian ủ có ảnh hưởng trực tiếp đến hàm lượng cordycepin. Ở nhiệt độ 25oC, pH 5,5 thời gian ủ là 21 ngày đã cho hàm lượng cordycepin tối đa. Nhiệt độ ban ngày là khoảng 23oC vào ban đêm là 16 oC Trong số các cơ chất thí nghiệm thì gạo nứt cho hàm lượng cordycepin cao nhất là 814 mg/g, tiếp theo là yến mạch và lúa mì lần lượt là 638,85mg/g và 565,2mg/g.

Nghiên cứu của L.T.Hung và CS (2009) về tác động của nhiệt độ lên 15 chủng C. militaris trong việc sản xuất cordycepin cho thấy chủng BCC2816 và BCC2819 cho hàm lượng cordycepin cao nhất tương ứng là 544,82 mg/lít và 587,68 mg/lít ở nhiệt độ 25oC. Tất cả các chủng nấm đều phát triển ở nhiệt độ từ 15oC – 30OC. Trên 30oC nấm ngừng phát triển, nhiệt độ thích hợp nhất là 25Oc.

Ảnh hưởng của yếu tố ánh sáng: Cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tạo quả thể nấm. Trong điều kiên che tối, việc tạo quả thể bị ức chế (Gao et al., 2000; Sato và Shimazu, 2002). Các nghiên cứu cho thấy cường độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởng của nấm có thể dao động tùy chủng nấm, tuy nhiên từ 500-1000 lux được xem là điều kiên thích hợp nhất (Sung et al., 1999; Gao et al., 2000; Sato và Shimazu, 2002). Cần thiết kế các chế độ chiếu sáng phù hợp trong phòng nuôi khi nuôi trong điều kiện nhân tạo đối với nấm C. militaris.

Theo Mohd Adnan và cs (2017) ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy là ánh sáng trắng có cường độ  từ 300-500lux chiếu sáng 12 giời/ngày.

Theo Yuh-Shuen Chen và CS (2011) nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng kim loại nhẹ và kim loại nặng lên sự phát triển của quả thể C. militaris trong môi trường ngũ cốc đã kết luận rằng: Chu kỳ sáng tối có ảnh hưởng đến việc hình thành quả thể. Diều kiện hình thành quả thể tốt nhất là chu kỳ sáng tối là 12 giờ sáng/tối. Trọng lượng quả thể tối đa và hàm lượng cordycepin cao nhất được thu từ môi trường gạo I, trong đó không phát hiện có chứa Pb và Hg và chỉ phát hiện có sự hiện diện của Cd. Trong 45 ngày nuôi cấy môi trường gạo I đã có trọng lượng quả thể lớn hơn và chiều cao quả thể cũng cao hơn môi trường gạo II và gạo III. Sự ức chế hình thành quả thể C. militaris tỉ lệ thuận với lượng kim loại nặng có trong gạo. Với nồng độ kim loại nặng ở mức 10ppm đã ức chế hoàn toàn việc hình thành quả thể.

Ảnh hưởng của độ thoáng khí và ẩm độ: Độ thoáng khí tốt kích thích sự sinh trưởng của sợi nấm và tổng sinh khối nấm. Các nghiên cứu cho thấy việc sử dụng màng bao HFM (hydrophobic fluoropore Membrane) cho kết quả tốt nhất về hiệu suất quả thể nấm C. militaris (Zhang et al., 2010). Khoảng ẩm độ thích hợp cho nấm dao động từ 70– 90 %, tương đương với độ ẩm không khí trong tự nhiên sẽ phù hợp cho việc tạo quả thể. Khi độ ẩm thấp sẽ làm môi trường khô nhanh hạn chế sự phát triển của sợi nấm cũng như quả thể. Do đó, trong phòng nấm cần bổ sung ẩm bằng máy phun ẩm với nguồn nước sạch khuẩn. Ngoài độ thoáng khí và ẩm độ, dịch nuôi cấy C. militari cần được chú ý duy trì pH trong khoảng 6.0–6.5, nhiêt đô ̣ 20–25°C và bổ sung các nguồn dinh dưỡng như carbohydrate, nitrogen và muối khoáng (Sung et al., 2006).

Nghiên cứu nâng cao chất lượng C. militaris: Khi Ting-chi Wen và CS (2014) nghiên cứu cấu tạo kiểu hình của C. militaris tác động đến vệc sản xuất cordycepin đã thấy: các khuẩn lạc màu cam hình thành quả thể nhanh hơn những khuẩn lạc có màu nhạt. Hàm lượng cordycepin giảm khi khuẩn lạc từ màu cam đến màu cam nhạt và màu trắng. Tuy nhiên không có mối liên hệ giữa việc hình thành cordycepin với tốc độ phát triển màu của khuẩn lạc. Khối lượng quả thể của các khuẩn lạc từ gốc ban đầu lớn hơn những khuẩn lạc được cấy chuyển sau này. Ngược lại, hàm lượng cordycepin ở các chủng được cấy lại cao hơn các chủng ban đầu. Ting-chi Wen và CS (2014) đã sử dụng môi trường có 20g gạo và 32 ml dung dịch (20 g/l sucrose, 10 g/l peptone, 0.1 g/l MgSO4.7H2O và 0.1 g/l KH2PO4). Sau khi đổ 5ml dung dịch C. militaris vào môi trường trên để trong điều kiện 12 ngày tối ở nhiệt độ 20oC. Qủa thể bắt đầu hình thành sau 12-15 ngày khi giảm nhiệt độ về ban đêm xuống còn 16oC, nhiệt độ ngày là 23oC với cường độ chiếu sáng là 500 lux, độ ẩm 90-95%. Sau khi quả thể bắt đầu hình thành duy trì nhiệt độ 23oC, độ ẩm 80-90% trong vòng 50-60 ngày quả thể dài 5-9cm.

Ting-chi Wen và CS (2014) nghiên cứu tác động của các yếu tố môi trường lên sự hình thành cordycepin đã xác dịnh được: môi trường thích hợp nhất cho sự phát triển khối lượng quả thể C. militaris là: 40 g/L glucose, 5 g/L peptone, 1.5 g/L MgSO4.7H2O, 1.5 g/L K2HPO4 và 1.0 mg/L NAA; môi trường thích hợp nhất cho hàm lượng cordycepin cao nhất là: 10 g/L peptone, 1.0 g/L MgSO4.7H2O, 1.0 g/L K2HPO4, 1.0 mg/L NAA. Thứ tự ảnh hưởng các yếu tố đển tăng trưởng khối lượng quả thể C. militaris: peptone > K2HPO4 > glucose > NAA > MgSO4.7H2O. Thứ tự ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng cordycepin là: peptone > NAA > K2HPO4 > MgSO4.7H2O > glucose.

Tác giả In-Pyo Hong và CS (2010) khi nghiên cứu tạo quả thể C. militaris trên tằm đã xác định được phương pháp sử dụng kim tiêm cho tỉ lệ hình thành quả thể C. militaris cao nhất. Tác giả cũng xác định được rằng độ tuổi của nhộng tốt nhất khi sử dụng để tiêm là từ 9-11 ngày ở độ tuổi này tỉ lệ thành công là 100%. Trong các nồng độ bào tử sử dụng cho nghiên cứu thì nồng độ 2×106 có tỉ lệ ký sinh trên nhộng tằm tốt nhất với 97,3%. Nồng độ 2×105 cho tỉ lệ nhộng bị ký sinh là 96,4% các nồng độ thấp hơn 2×104, 2×103 cho tỉ lệ nhộng bị ký sinh < 10%. Kết quả nghiên cứu của In-Pyo và CS (2010) cũng cho thấy rằng liều lượng sử dụng cho mỗi cá thể nhộng tằm dao động từ 0,025ml – 0,1ml có tỉ lệ ký sinh là 98 – 100%, liêu lượng tốt nhất là 0,05ml – 0,075ml có tỉ lệ ký sinh 100%. Trong các ngiên cứu sử dụng ánh sáng có cường độ 100-1000lux, kết quả cho thấy rằng ánh sáng có cường độ 1000 lux là tốt nhất với chiều dài quả thể là 69,7mm và đường kính là 2,4 mm.

Qiang Zhang và CS (2016) đã mô tả quá trình sinh tổng hợp cordycepin qua quá trình lên men lỏng. Tác giả đã xác định được các chất phụ gia đều có ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp corydycepin trong đó hai yếu tố quan trọng nhất là được xác định là Fe2+ và NH4+. Việc bổ xung hai yếu tố trên có hiệu quả đối với việc sinh tổng hợp cordycepin trong việc lên men lỏng.

Tang J.P và CS (2015) đã tiến hành lên men hai lần để làm tăng hàm lượng cordycepin. Kết quả nghiên cứu của tác giả cho thấy có sự khác biệt về sự tăng trưởng, phát triển của tế bào và quá trình sinh tổng hợp cordycepin trong lên men bề mặt và lên men động. các sợi nấm phát triển nhanh hơn trong quá trình lên men động. Tuy nhiên lượng cordycepin được sinh ra nhiều trong quá trình lên men bề mặt.

Chao Kang và CS (2014) nghiên cứu tác động của môi trường lên sự hình thành Cordycepin trong điều kiện lên men tĩnh đã cho kết quả là mô trường tối ưu chứa pepton 20g/l; sucrose 24,7g/l; K2HPO4.3H20 1,1g/l; MgSO4 0,9 g/l; VB1 10mg/l; hypoxanthine 5,45g/l; L-alanin 12,23g/l. Được nôi cấy trong điều kiện tối 6-8 ngày ở nhiệt độ 25oC với pH không thay đổi cho hàm lượng cordycepin tối đa là 2008,48 mg/l/.

5. Vấn đề thoái hóa giống trong nuôi cấy nấm C. militaris

Thoái hóa giống là vấn đề quan trọng trong việc nuôi trồng nấm C. militaris trong điều kiện nhân tạo. Sự thoái hóa giống thể hiện ở việc giảm tốc độ sinh trưởng, giảm mật độ sợi nấm, màu sắc sợi và năng suất quả thể, cũng như các thay đổi về hình dạng và kích thước quả thể. Ngoài ra, sự thoái hóa giống còn thể hiện ở việc làm giảm hàm lượng các chất có lợi tạo ra trong môi trường nuôi cấy và trong quả thể nấm. Thoái hóa trong tạo quả thể thường có liên quan đến vật vật liệu dùng phân lập. Nếu giống được phân lập từ đa bào tử hoặc mô, việc thoái hóa giống sẽ xảy ra ở lần nuôi cấy thứ hai hoặc ba (Shrestha ̣ et al., 2004). Tuy nhiên, giống nấm C. militaris ı́t thoái hóa hơn khi được phân lập từ các đơn bào tử (Shrestha et al., 2004; Sung et al., 2006). Việc giảm sắc tố cũng được ghi nhận khi nuôi trồng nấm sau vài lần nhân giống (Sung et al., 2006). Hoạt tính của enzyme dehydrogenase và sắc tố giảm như trong nghiên cứu của Lin et al. 2010. Một số nghiên cứu cho thấy việc bảo quản giống ở 4-100C có thể duy trì khả năng tạo quả thể đến 6 tháng (Sung et al., 2006; Geng et al., 2009). Các nghiên cứu trên gen cũng chỉ ra rằng có sự liên hệ giữa các biến đổi ở mức độ gen và sự thoái hóa giống của nấm C. militaris (Li et al., 2003), tuy nhiên các gen chính xác liên quan đến quá trình này vẫn chưa được xác định. Khi phát triển quy trình nuôi cấy hiệu quả nấm C. militaris các nhà sản xuất cần đáp ứng các yêu cầu về giống nấm, duy trì năng suất quả thể và hàm lượng cordycepin trong quả thể cao. Du và ctv. (2010) phát triển phương pháp nuôi cấy đạt hàm lượng cordycepin cao (24.98 mg/g quả thể) trong khi Che và ctv. (2004) tao ra chủng nấm có năng suất cao và ổn định hơn nhờ đột biến bằng tia UV (Che et al., 2004; Du et al., 2010). Nấm thường được nuôi trong các chai nhỏ 0.5- 1 lı́t do nấm đòi hỏi độ ẩm cao. Sử dụng các chai nhựa trong hoặc chai thủy tinh thích hợp cho việc phát triển hệ sợi và quả thể nấm, đồng thời có thể tái sử dụng làm giảm chi phí trong sản xuất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đỗ Tuấn Bách, Vũ Hoài Nam, Ma Thị Trang, Hà Văn Hướng, Nguyễn Mạnh Cường, Nguyễn Huy Thuần, Dương Văn Cường (2017), Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện nuôi trồng tới khả năng tạo quả thể của nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris. Tạp chí Khoa học & Công nghệ 161(01): 113 – 118.
2. Hoàng Tiến Công (2010), Nghiên cứu thành phần loài nấm Đôngtrùng hạ thảo tại Khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử, huyện Sơn Động, tỉnh Bắc Giang, Luận văn thạc sỹ nông nghiệp, Đại học Thái Nguyên – Trường đại học Nông Lâm, Thái Nguyên.
3. Trần Thu Hà, Lê Văn Vẻ, Nguyễn Nam Giang, Phạm Thị Thu, Nguyễn Duy Trình, (2016), Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự sinh trưởng của nấm Đông trùng hạ thảo trong môi trường nhân giống dịch thể, Tạp chí khoa học và công nghệ Việt Nam, 7(8) 8.
4. Nguyễn Thị Minh Hằng, Bùi Văn Thắng (2017), Nghiên cứu nuôi trồng nấm đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) trên giá thể tổng hợp và nhộng tằm, tạp chí khoa học và công nghệ lâm nghiệp số 4, 10-16.
5. Trần Thu Hà (2015), Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống và nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.ex Fr.) mới nhập nội ở Việt Nam, Luận văn thạc sỹ nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội.
6. Trịnh Tam Kiệt, 1996. Danh mục các loài nấm lớn Việt Nam, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
7. Trịnh Tam Kiệt, Đặng Vũ Thanh, Hà Minh Trung, 2001. Lớp Ascomycetes, Danh lục các loài thực vật Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội
8. Phạm Thị Lan, Đỗ Hải Lan, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Bạc Thị Thu, Phạm Văn Nhã, Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng tới sinh trưởng, phát triển và hàm lượng hoạt chất cordycepin của nấm Cordyceps militaris NBRC 100741 trên nhộng tằm, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 63-72.
9. Nguyễn Thị Liên Thương, Trịnh Diệp Phương Danh, Nguyễn Văn Hiệp (2015), Nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris: Đặc điểm sinh học, giá trị dược liệu và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi trồng nấm, Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, 44b: 9-22.
10. Nguyễn Thị Thanh Thủy, Phí Quyết Tiến (2017), Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy và chế độ ngâm chiết tới sự biến đối thành phần hóa học và cảm quan của giá thể sau thu hoạch đông trùng hạ thảo, tạp chí khoa học và công nghệ Việt Nam, số 7 (80) 52-57.
11. Phạm Quang Thu, 2009. Điều tra phát hiện nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps nutans Pat. Phân bố ở Khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử – Sơn Động – Bắc Giang. Tạp chí Nông nghiệp & phát triển nông thôn 4/2009, trang 91-94.
12. Phạm Quang Thu (2015) Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L. : Fr.) Link có giá trị dược liệu và thương mại cao.
13. Trần Văn Tú (2011), nghiên cứu thành phần loài nấm đông trùng hạ thảo tại vườn quốc gia Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai, luận văn thạc sỹ lâm nghiệp, Đại học Thái Nguyên – Trường đại học Nông Lâm, Thái Nguyên.
14. Lê Văn Vẻ, Trần Thu Hà, Nguyễn Thị Bích Thùy, Ngô Xuân Nghiễn (2015), Bước đầu nghiên cứu công nghệ nuôi trồng nhộng trùng thào (Cordyceps militaris L.ex Fr.) ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học và Phát triển, tập 13, số 3: 445-454
15. Ahn Y.J., Park S.J., Lee S.G., Shin S.C., Choi D.H. 2000. Cordycepin: selective growth inhibitor derived from liquid culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp. J. Agric. Food Chem., 48:2744-2748.
16. Ana Bizarro, Isabel C. F. R. Ferreira, Marina Soković, Leo J. L. D. van Griensven, Diana Sousa, M. Helena Vasconcelos and Raquel T. Lima (2015), Cordyceps militaris (L.) Link Fruiting Body Reduces the Growth of a Non-Small Cell Lung Cancer Cell Line by Increasing Cellular Levels of p53 and p21, Molecules, 20, 13927-13940.
17. Andrej Gregori (2014) Cordycepin production by Cordyceps militaris cultivation on spent brewery grains, Acta Biologica Slovenica, 57 (2)
18. Bhushan Shrestha, Sang-Kuk Han, Kwon-Sang Yoon1 and Jae-Mo Sung, Morphological Characteristics of Conidiogenesis in Cordyceps militaris, Mycobiology 33(2): 69-76 (2005).
19. Byung-Tae P., Kwang-Heum N., Eui-Cha J., JaeWan P., Ha-Hyung K., 2009. Antifungal and Anticancer Activities of a Protein from the Mushroom Cordyceps militaris. Korean Journal of Physiol Pharmacology 13: 49 – 54.
20. Caihong Donga, Suping Guob, Wenfeng Wangc and Xingzhong Liua (2015), Cordyceps industry in China,, Mycology, 6:2, 121-129.
21. Chang, H. L., Chao, G. R., Chen, C. C., Mau, J. L., 2001. Non-volatile taste components of Agaricus blazei, Antrodia camphorata and Cordyceps militarismtcelia. Food Chemistry. 74:203-207.
22. Chao Kang, Ting-Chi Wen, Ji-Chuan Kang, Ze-Bing Meng,1Guang-Rong Li, and Kevin D. Hyde , Optimization of Large-Scale Culture Conditions for the Production of Cordycepin with Cordyceps militaris by Liquid Static Culture, The Scientific World Journal Volume 2014, Article ID 510627, 15 pages
23. Chen, Y.Q., Wang, N., Qu, L., Li., T., and Zhang, W. (2001). Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.85 rDNA. Biochemical Systematics and Ecology 29: 597-607
24. Das S.K., Masuda M., Mikio S., 2010. Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: current state and prospects. Fitoterapia. 81:961–968.
25. Fengyao W., Hui Y., Xiaoning M., Junqing J., Guozheng Zh., Xijie G. and Zhongzheng G., 2011. Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris. African Journal of Microbiology Research. 5(18): 2743-2751.
26. Filipa S. Reisa, Lillian Barrosa, Ricardo C. Calhelhaa, Ana Ćirićb, Leo J.L.D. van Griensvenc, Marina Sokovićb, Isabel C.F.R. Ferreira, The methanolic extract of Cordyceps militaris (L.) Link fruiting body shows antioxidant, antibacterial, antifungal and anti human tumor cell lines properties, Food and Chemical Toxicology, Volume 62, December 2013, Pages 91-98.
27. Gao Jian, LIAN Ze-qin, ZHU Ping, ZHU Hai-bo, Lipid-lowering effect of cordycepin (3′-deoxyadenosine) from Cordyceps militaris on hyperlipidemic hamsters and rats, Acta Pharmaceutica Sinica 2011, 46 (6): 669-676.
28. Gi-Ho Sung, Nigel L. Hywel-Jones, Jae-Mo Sung, J. Jennifer Luangsa-ard, Bhushan Shrestha and Joseph W. Spatafora. (2007), Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi. Studies in Mycology 57: 5–59
29. Hui-juan Liu, Hao-binHu, ChuChu, QinLi, PingLi, (2011), Morphological and microscopic identification studies of Cordyceps and its counterfeits, Acta Pharmaceutica Sinica B 2011;1(3):189–195
30. Hur H., 2008. Chemical Ingredients of Cordyceps militaris. Mycobiology. 36(4):233-235.
31. In-Pyo Hong, Pil-Don Kang, Ki-Young Kim, Sung-Hee Nam, Man-Young Lee, Yong-Soo Choi, Nam-Suk Kim, Hye-Kyung Kim, Kwang-Gill Lee1 and Richard A. Humber Fruit Body Formation on Silkworm by Cordyceps militaris, Mycobiology 38(2) : 128-132 (2010)
32. Jae Sung Kim, Kumar Sapkota, Se-Eun Park, Bong-Suk Choi, Seung Kim, Nguyen Thi Hiep, Chun-Sung Kim, Han-Seok Choi, Myung-Kon Kim, Hong Sung Chun, Yeal Park, and Sung-Jun Kim. 2006. A Fibrinolytic Enzyme from the Medicinal Mushroom Cordyceps militaris. The Journal of Microbiology, Dec. 2006, p. 622-631. Vol. 44, No. 6
33. Jae-Sung K., Kumar S., Se-Eun P., Bong-Suk C.i, Seung K., Nguyen T. H., Chun-Sung K., Han-Seok C., Myung-Kon K., HongSung C., Yeal P., Sung-Jun K., 2006. A Fibrinolytic Enzyme from the Medicinal Mushroom Cordyceps militaris. Journal of Microbiology 44(6):622-31.
34. Jae-Won Ha, Hwa-Seung Yoo, Jang-Woo Shin, Jung-Hyo Cho, Nan-Heon Lee, Dam-Hee Yoon, Yeon-Weol Lee, Chang-Gue Son, Chong-Kwan Cho (2006), Effects of Cordyceps Militaris Extract on Tumor Immunity, Korean Journal of Oriental Medicine, Vol. 27. No. 4. 12-29.
35. Jin Young Heo, Hyun Wook Baik, Hyuk Jung Kim, Jae Min Lee, Hyung Woo Kim, Yong Sun Choi, Jung Ho Won, Hyun Mi Kim, Won I Park, Chul Young Kim, The Efficacy and Safety of Cordyceps militaris in Korean Adults Who Have Mild Liver Dysfunction, Journal of Clinical Nutrition, 2015;7(3):81-86
36. K.J. Patel, R.S Ingalhalli (2013) Cordyceps militaris (L.: Fr.) Link An Important Medicinal Mushroom, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, Vol. 2 No.1, page 315-319.
37. Kamble V.R. and Agre D.G., 2012. Reinvestigation of insect parasite fungus Cordyceps militaris from Maharashtra. Bionano Frontier 5(2):224-225.
38. Kang C, Wen TC, Kang JC, Meng ZB, Li GR, Hyde KD, (2014), Optimization of large-scale culture conditions for the production of cordycepin with Cordyceps militaris by liquid static culture. The Scientific World Journal Article ID 510627.
39. Khan, M.A., Tania, M., Zhang, D.Z. and Chen, H. (2010). Cordyceps mushroom: a potent anticancer nutraceutical, Open Nutraceuticals J., 3:179-183.
40. Klaunig JE, Kamendulis LM. 2004. The role of oxidative stress in carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. 44: 239-267.
41. Kobayasi Y., 1982. Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella. Transactions of the Mycological Society of Japan 23:329–364 Herbal, New York.
41. L.T. Hung, S. Keawsompong, V.T. Hanh, S. Sivichai and N.L. Hywel-Jones (2009), Effect of Temperature on Cordycepin Production in Cordyceps militaris, Thai Journal of Agricultural Science, 42(4): 219-225
42. Lee H, Kim Y.J., Kim H.W., Lee D.H., Sung M.K., Park T. 2006. Induction of apoptosis by Cordyceps militaris through activation of caspase-3 in leukemia HL-60 cells. Biol. Pharm. Bull. 29: 670-674
43. Lei Zhong, Liyan Zhao, Fangmei Yang, Wenjian Yang, Yong Sun and Qiuhui Hu, Evaluation of anti-fatigue property of the extruded product of cereal grains mixed with Cordyceps militaris on mice, Journal of the International Society of Sports Nutrition (2017) 14:15
44. Lin W.H., Tsai M.T., Chen Y.S., Hou R.C., Hung H.F., Li C.H., Wang H.K., Lai M.N., Jeng K.C., 2007. Improvement in sperm production in subfertile boars by Cordyceps militaris. The American Journal of Chinese Medicine.35(4):631-41.
45. Mani A, Thawani V và Zaidi KU (2016), An effective approach of strain improvement in Cordyceps militaris using abrin, Current Research in Environmental & Applied Mycology 6 (3): 166–172.
46. Mao X.L. (2000), The macrofungi in China, Henam Technical and Science Publication House.
47. Mizuno T., 1999. Medicinal Effects and Utilization of Cordyceps (Fr.) Link (Ascomycetes) and Isaria Fr. (Mitosporic Fungi) Chineese Caterpiller Fungi, “Tochukaso” (Review). International Journal of Medicinal Mushrooms. 1:251-261.
48. Mohammad Soltani, Mohanad Al-Ali, Nor Zalina Othman, Roslinda Malik, Nagib Elmarzugi, Ramlan Aziz, Hesham A. El-Enshasy, Medium Composition Effects on Growth Kinetic of Cordyceps militaris Cells Using Agar Plate Method, Journal of Pharmacy and Biological Sciences, Volume 10, Issue 1 Ver. 1 (Jan -Feb. 2015), PP 79-82
49. Mohd Adnan, Syed Amir Ashraf, Saif Khan, Eyad Alshammari & Amir Mahgoub Awadelkareem (2017) Effect of pH, temperature and incubation time on cordycepin production from Cordyceps militaris using solid-state fermentation on various substrates, CyTA – Journal of Food, 15:4, 617-621,
50. Naru Kang, Hyun Hee Lee, Inmyoung Park, and Young Su Seo (2017),  Development of High Cordycepin-Producing Cordyceps militaris Strains, Mycobiology,  Mar; 45(1): 31–38.
51. Park, J.P., Kim, S.W., Hwang, H.J. and Yun J.W. (2001). Optimuzation of submerged culture condition for mycelial growth and exo-biopolymer production by Cordyceps militaris, Lett Appl Microbiol, 33(1):76-81.
52. Paul M. K., Paul F. C., David W. M. and Stalpers J. A. (2008). Dictionary of the Fungi; CABI.
53. Pooja Pathania and Anand Sagar, Studies on antibacterial activity of cordyceps militaris (l.) Link, International Journal of Pharma and Bio Sciences, 2014 Oct; 5(4): (B) 61 – 68.
54. Pooja Pathania, Madhavi Joshi, Anand Sagar, Morphological, Physiological and Molecular studies on wildly collected Cordyceps militaris from North West Himalayas, India, European Journal of Biotechnology and Bioscience 2015; 3 (1): 53-62
55. Qiang Zhang, Yi Liu, Zhibiao Di, Chun Chao Han and Zhenquan Liu, The Strategies for Increasing Cordycepin Production of Cordyceps Militaris by Liquid Fermentation,Fungal Genom Biol 2016, 6:1
56. Seulmee S., Sungwon L., Jeonghak K., Sunhee M., Seungjeong L., Chong-Kil L., Kyunghae C., Nam-Joo H., Kyungjae K., 2009. Cordycepin Suppresses Expression of Diabetes Regulating Genes by Inhibition of Lipopolysaccharide-induced Inflammation in Macrophages. Immune Network. 9(3):98-105.
57. Shih I.L., Tsai K.L., Hsieh C.Y., 2007. Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris. Biochemical Engineering Journal. 33, 193–201.
58. Shonkor K. D., Shinya F., Mina M. and Akihiko S., 2010. Efficient Production of Anticancer Agent Cordycepin by Repeated Batch Culture of Cordyceps militaris Mutant. Lecture Notes in Engineering and Computer Science. 20-22.
59. Shrestha B., Lee W.H., Han S.K., Sung J.M., 2006. Observations on Some of the Mycelial Growth and Pigmentation Characteristics of Cordyceps militarisIsolates. Mycobiology. 34(2):83-91.
60. Sung G.H., Spatafora J.W., 2004. Cordyceps cardinali ssp. nov., a new species of Cordyceps with an east Asian-eastern North American distribution. Mycologia 96:658–666.
61. Sung J.M., Park Y.J., Lee J.O., 2007. Effect of preservation periods and subcultures on fruiting body formation of Cordyceps militaris in vitro. Mycobiology 34:196–199 Supplements. American Journal of Chinese Medicine. 35(4):631-41.
62. Sung Jae Mo (2000), Insect-born fungus of Korea, Kangwon National Univ.,Korea.
63. Tang J.P., Qian Z.Q., Zhu L., 2015, Two-step shake-static fermentation to enhance cordycepin production by cordyceps militaris, Chemical Engineering Transactions, 46, 19-24.
64. Ting-chi Wen, Guang-rong Li, Ji-chuan Kang , Chao Kang and Kevin D. Hyde, Optimization of Solid-state Fermentation for Fruiting Body Growth and Cordycepin Production by Cordyceps militaris, Chiang Mai J. Sci. 2014; 41(4) : 858-872
65. Ting-chi Wen, Ji-chuan Kang, Kevin D. Hyde, Guang-rong Li, Chao Kang and Xu Chen, Phenotypic Marking of Cordyceps militaris Fruiting-Bodies and Their Cordycepin Production, Chiang Mai J. Sci. 2014; 41(4) : 846-857.
66. Tsuguo Hongo, Masana Izawa (1994). Mushroom in Japan, Yama-Kei publisher, Japan.
67. Wang L., Zhang W.M., Hu B., 2008. Genetic variation of Cordyceps militaris and its allies based on phylogenetic analysis of rDNA ITS sequence data. Fungal Divers 31:147–155.
68. Wang, R., Xu, Y., Ji, P., Wang, X., Holliday, J (2001) Clinical Trial Of A Mixture of Six Medicinal Mushroom Extracts. http://alohamedicinals.com/clinical_trials.html 2001
69. Wen TC, Long FY, Kang C, Wang F, Zeng W, Effects of additives and bioreactors on cordycepin production from Cordyceps militaris in liquid static culture, Mycosphere 8(7): 886–898 (2017).
70. Wol-Soon J., Yoo-Jin C., Hyoun-Ji K., Jae-Yun L., Byung-Hyouk N., Jae-Dong L., SangWha L., Su-Yeong S. and Min-Ho J., 2010 .The Anti-inflammatory Effects of Water Extract from Cordyceps militaris in Murine Macrophage. Mycobiology. 38(1): 46-51.
71. Won S.Y. and Park E.H. 2005. Anti-inflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris. J. Ethnopharmacol .96: 555- 561.
72. Wu TF. The Medicinal Efficacies of Cordyceps Militaris (L.) Link. J Microbiol Biotechnol, 2016, 1(2): 000110.
73. Yan H., Zhu D., Xu D., Wu J. and Bian X., 2008. A study on Cordyceps militaris polysaccharide purification, composition and activity analysis. African Journal of Biotechnology. 7 (22): 4004-4009.
74. Yoo H.S., Shin J.W., Cho J.H., Son C.G., Lee Y.W., Park S.Y., Cho C.K. 2004. Effect of Cordyceps militaris extract on angiogenesis and tumor growth. Acta Pharmacol. Sin. 25: 657-65
75. Young-Joon A., Suck-Joon P., Sang-Gil L., Sang-Cheol S. and Don-Ha C., 2000. Cordycepin: Selective Growth Inhibitor Derived from Liquid Culture of Cordyceps militaris against Clostridium spp. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48: 2744-2748.
76. Yuh-Shuen Chen, Bing-Lan Liu, and Yaw-Nan Chang, Effects of light and heavy metals on Cordyceps militaris fruit body growth in rice grain-based cultivation, Korean J. Chem. Eng., 28(3), 875-879 (2011)
77. Yuko O., Jung-Bum L., Kyoko H., Akio F., DongKi P. and Toshimitsu H., 2007. In Vivo Antiinfluenza Virus Activity of an Immunomodulatory Acidic Polysaccharide Isolated from Cordyceps militaris Grown on Germinated Soybeans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55: 10194–10199.
78. Zhou Yifeng, Cai Zhongxiong, Qin Enhua, Tang Qiaoyu, Effects of selenium on metabolism and total antioxidation of Cordyceps militari hypha,
79. Zhu, Jia-Shi, Halpern, G., Jones ,K (1998) The Scientific Rediscovery of an Ancient Chinese Herbal Medicine: Cordyceps sinensis The Journal Of Alternative And Complementary Medicine [part 1]Volume 4, Number 3, 1998, pp. 289—303 [part 2] Volume 4, Number 4, 1998, pp. 429 – 457.

Nguồn: Update…